Диагностика Chlamydia trachomatis методом ПЦР

Технология:

Дороговизна, длительность и трудоемкость микробиологического выделения хламидий в культуре существенно затрудняет использование этой процедуры в рутинной лабораторной диагностике. В литературе накоплен обширный клинико-лабораторный опыт по использованию метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) для выявления Chlamydia trachomatis. Особое внимание при его использовании следует уделять, без сомнения, вопросам правильной интерпретации получаемых результатов. Экстремально высокие показатели чувствительности и специфичности ПЦР делают эту методику во многом революционной в лабораторной диагностике. Основными мишенями при выявлении Chlamydia trachomatis являются нуклеотидная последовательность видоспецифической криптической плазмиды, последовательность главного белка внутренней мембраны, рибосомальные гены.

Данная реакция представляет собой многократно повторяющиеся циклы синтеза (амплификацию) специфической области ДНК-мишени в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы, дезоксинуклеотидтрифосфатов, соответствующего солевого буфера и олигонуклеотидных затравок-праймеров, определяющих границы амплифицируемого участка. Каждый цикл состоит из трех стадий с различными температурными режимами. На первой стадии при 94 ⁰ С происходит разделение цепей ДНК, затем при 56-58 ⁰ C- присоединение (отжиг) праймеров к комплементарным последовательностям на ДНК-мишени, и при температуре 72 ⁰ C протекает синтез новых цепей ДНК путем достраивания цепей праймеров в направлении 5^{`</sup> -3<sup>`} . В каждом цикле происходит удвоение числа копий амплифицируемого участка, что позволяет за 25-40 циклов наработать фрагмент ДНК, ограниченный парой выбранных праймеров, в количестве, достаточном для ее детекции с помощью электрофореза или альтернативными ему технологиями.

По сравнению с широко применяющимися иммунологическими тестами ПЦР-диагностика обладает рядом преимуществ:

• высокой и регулируемой специфичностью, обусловленной лишь нуклеотидной последовательностью, применяемой в данной диагностической системе;
• высокой чувствительностью, позволяющей диагносцировать не только острые, но и латентные инфекции (возможно выявление даже единичных бактерий или вирусов);
• химическое сходство всех нуклеиновых кислот позволяет разрабатывать универсальные процедуры для выявления различных инфекционных агентов;
• возможностью идентификации возбудителя в течении 4,5-5 часов.

Доставка биоматериала в ПЦР-лабораторию производится в холодовом термоконтейнере или термосе со льдом. Важной отличительной особенностью ПЦР-диагностики является относительно низкая стоимость оборудования для проведения анализа, сочетающаяся с универсальностью метода, что позволяет выявлять весь спектр клинически актуальных инфекционных агентов.

ПЦР-лаборатория должна быть разделена на зоны (комнаты). Cледует иметь не менее двух комнат:

• пре-ПЦР-помещение, где проводится обработка клинических образцов, выделение ДНК, приготовление реакционной смеси для ПЦР и постановка ПЦР (при наличии условий два последних этапа рекомендуется также проводить в дополнительном отдельном помещении);
  в этих помещениях запрещается проводить все другие виды работ с инфекционными агентами (микробиологический анализ, ИФА, другие диагностические тесты), ПЦР-диагностика которых проводится в данной лаборатории.
• пост-ПЦР-помещение, где проводится детекция продуктов амплификации, в ПЦР-помещении допускается использовать другие методы детекции инфекций, диагностика которых проводится в данной лаборатории. Комнату детекции продуктов амплификации (пост-ПЦР-помещение) следует располагать как можно дальше от пре-ПЦР-помещений. Следует исключить движение воздушного потока из пост-ПЦР-помещения в пре-ПЦР-помещение.

В комнате приготовления реакционной смеси и в комнате обработки клинических образцов должны быть установлены ультрафиолетовые лампы, рабочие поверхности в лаборатории должны обрабатываться дезинфицирующими растворами.

Показания:

1. Острая фаза заболевания.
2. Хроническая фаза заболевания.
3. Установление этиологии хронического инфекционного процесса урогенитального тракта.
4. Беременность с отягощенным акушерским анамнезом.
5. Бесплодие неясного генеза.
6. Контроль эффективности проведенного антибактериального лечения. В случае выявления фрагмента ДНК хламидии трахоматис после курса химиотерапии следует провести культуральную диагностику для исключения “ложноположительного с клинической точки зрения результата”. Если проведение культуральной диагностики невозможно, то необходимо через 5-6 недель (полное обновление эпителиального покрова мочеполовых путей) провести повторное исследование методом ПЦР.
7. Выявление хламидий у ВИЧ-инфицированных лиц, больных туберкулезом, вирусным гепатитом и со вторичными иммунодефицитными состояними (онкологические больные после курсов химио- и лучевой терапии, трансплантации костного мозга, получающие иммуносупрессивную терапию).

Современные тест-системы:

В 1991 году компания Хоффман-ла Рош ЛТД получила от компании Cetus права и патенты на использование ПЦР. В этом же году была создан Roche Molecular Systems, занимающийся исключительно вопросами развития и совершенствования ПЦР. В 1992 году были внедрены первые стандартизованные тест-системы для клинической ПЦР-диагностики AMPLICOR Chlamydia trachomatis, а в 1993 году начато производство этих тест систем. Многочисленные проведенные исследования показали высокую чувствительность и специфичность данного набора. Это позволило получить данной тест-системе сертификат Food and Drug Administration (FDA) в 1993 году. В 1995 году появился новый набор AMPLICOR Chlamydia trachomatis/Neisseria gonorrhoeae для одновременной их детекции в одной пробирке. В тесте использованы биотинилированные праймеры (СР24/CР27) из криптической плазмиды C. trachomatis. Чувствительность теста составляет 10 копий/мл, специфичность 99,6%. Тест-система включает: набор для сбора и транспортировки образцов, набор для выделения ДНК из цервикальных, уретральных образцов и мочи, набор для амплификации и детекции. Все наборы стандартизованы, полностью готовы к использованию, имеют внутренний контроль, систему защиты от контаминаций.

Научно-производственной фирмой “Литех” при НИИ физико-химической медицины МЗ РФ выпускается набор реагентов “Полимик” в виде трех отдельных наборов для определения соответственно Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealiticum. Каждый набор “Полимик” комплектуется отдельным набором для выделения ДНК из биопроб. Инструкция по применению набора реагентов рекомендована к утверждению экспертной комиссией Комитета по новой медицинской технике МЗ РФ (протокол No 3 от 18.03.96 г.) и утверждена Министерством здравоохранения РФ 17.05.96 г. (ТУ 9398-405-17253567-96).

В состав реакционной смеси набора “Полимик” входит внутренний контроль (рекомбинантная плазмида, содержащая фрагмент-вставку размером 308 н.п.). Этот компонент позволяет контролировать процесс прохождения реакции амплификации, а также тестировать наличие в пробах веществ, ингибирующих ПЦР. Полоса, соответствующая внутреннему контролю, должна проявляться как в положительном и в отрицательном контролях, так и во всех тестируемых пробах.

При выделении ДНК из биопробы (“Набор для выделения ДНК”) используется метод экстракции ДНК из клеток хламидий с помощью гуанидина тиоцианата и связывания высвобождающихся нуклеиновых кислот с частицами крупнопористого стекла. Это позволяет оптимизировать условия выделения и подготовки проб для амплификации, а также уменьшить количество манипуляций с образцом. При этом все манипуляции проводятся в одной пробирке. Выход хромосомной ДНК составляет 70-80% по результатам определения числа колониеобразующих единиц клеток Acholeplasma laidlawii (штамм микоплазм, взятый в качестве стандарта) как в случае чистой культуры, так и при добавлении этих клеток к клиническому материалу, не содержащему определяемых инфекционных агентов.

После завершения ПЦР продукты амплификации фракционируют методом электрофореза в 1,5% агарозном геле.

Анализ результатов диагностики:

1. положительном контрольном образце для хламидии выявляется полоса размером 501 н.п.
2. В отрицательном контрольном образце полоса, соответствующая фрагментам генома, хламидии должна отсутствовать. Появление полосы в отрицательном контроле свидетельствует о контаминации компонентов набора.
3. В анализируемой пробе отсутствие полосы строго на уровне соответствующего контроля свидетельствует об отсутствии возбудителя в пробе, наличие полосы, соответствующей по электрофоретической подвижности положительному контролю, свидетельствует о наличии хламидии в клинической пробе.
4. Во всех образцах выявляется полоса оранжево-красного цвета, соответствующая внутреннему контролю размером 308 н.п. Полученные результаты можно документировать фотографированием гелей с использованием оранжевого или интерференционного (594 нм) светофильтра. При использовании видеосистемы “Gel-doс” возможно документирование результатов электрофореза в виде компьютерного файла, доступного любым приложениям “Windows”.

Набор “Полимик” следует хранить при температуре -- 18-20 ⁰ С в течение всего срока годности (6 месяцев). Допускается хранение и транcпортировка набора при температуре не выше 0 ^о градусов не более одних суток.

В настоящее время (по состоянию на третий квартал 1999 г.) Минздравом России помимо набора “Полимик” разрешены следующие диагностические наборы для обнаружения хламидии трахоматис методом ПЦР в качестве изделий медицинского назначения:

• набор реагентов амплификационный для определения ДНК хламидий (Хламидия-Ампли-тест) ТУ 9398-402-18137053-96 производства АО “ВНЦМДЛ”, Москва;
• набор реактивов для выявления нуклеотидных последовательностей хламидия трахоматис методом ПЦР (Хлам Ам) ТУ 9398-403-29032954-96 производства ЗАО “Внедрение систем в медицину”, Москва;
• набор реагентов для выявления ДНК хламидии трахоматис методом ПЦР (Хлам-Ген) ТУ 9398-412-46482062-97 производства НПФ “ДНК-технология”, Москва.

В таблицах 18 и 19 приведены данные А.В. Савичевой и М.А. Башмаковой по выявлению хламидии трахоматис в клинических пробах различными методами исследования. Использованы выборки из исследований, в которых хотя бы одним из методов они были бы обнаружены. Видно преимущество ПЦР как при исследовании первичных материалов, так и при детекции ДНК хламидий в клеточной культуре, зараженной клиническим материалом. В таблице 20 приведены данные о недостатках и достоинствах этих методов.

Таблица 18. Сравнительная чувствительность прямых методов исследования (ПИФ, ПЦР, ИФА) при выявлении С. trachomatis в клинических образцах

Таблица 19. Сравнительная чувствительность прямых методов исследования (ПИФ, ПЦР) при выявлении C. trachomatis в клеточной культуре, зараженной клиническим материалом

Таблица 20. Достоинства и недостатки различных методов обнаружения Chlamydia trachomatis (Taylor-Robinson D., Thomas B.J.,1991, c дополнениями Говорун В.M, Бочкарев Е.Г., Парфенова Т.М.,1999)